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血浆dna

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性别:男 年龄:24岁

病情描述:

1ML鹅血液提取DNA时,当我在加了10ul蛋白酶K, 裂解液消化过夜时,后来发现蛋白质特别多,请问下,是不是上面两种物质加少了。DNA提取时特别粘稠,很难取上清液怎么办?有什么好的处理方法?

张双彦
张双彦 职称:主任医师
哈医大四院 神经内科
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问题分析:1 吸20ul蛋白酶K加入2.0ml微量离心管底部。2 加入200ul待提取的样品于微量离心管中。3 加入200ul Buffer AL缓冲液于离心管中,旋涡15秒。4 放入56℃水浴10分钟5 离心5秒钟,以便离下附于管壁上的水珠。6 加入200ul无水乙醇于离心管中,旋涡混匀15秒后,短暂离心。7 小心地将上述混合液加入QIAamp管柱中,尽量不要溅到管壁四周并在下套一个2ml收集管,盖紧管帽后离心1分钟(6000g,8000转/分),然后丢弃下面的收集管,重新套上一个新的收集管。8 加入500ul BufferAW1缓冲液于QIAmp管柱中,尽量不要碰到管壁,盖紧管帽后离心1分钟(6000g,8000转/分),然后丢弃下面的收集管,重新套上一个新的收集管9 加入500ul BufferAW2缓冲液于QIAamp管柱中,尽量不要碰到管壁,盖紧管帽后离心3分钟(14000转/分,20000g)10 丢弃下面的收集管,重新套上一个1.5ml微量离心管,最高速离心1min,以彻底除去BufferAW2。11 QIAamp管重新套上一个1.5ml微量离心管,打开QIAamp管,加入200ul BufferAE缓冲液,室温静置5分钟,然后离心1分钟(8000转/分),取下洗脱后的1.5ml微量离心管,将收集到的DNA提取液经核酸测定仪测得DNA浓度及纯度,一20℃存放备用。

2014-08-12
吴伟
吴伟 职称:副主任医师
山东大学齐鲁医院 神经内科
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问题分析:1 材料和方法  1.1 样本来源 静脉抽取30份健康体检者血样。10份用EDTA抗凝, 10份不加抗凝处理,10份不抗凝在-40 ℃冻存2 a左右。  1.2 DNA提取方法 取凝血块,用9 g/L 氯化钠匀浆大约30 s,每换一个样本都要用70%乙醇和9 g/L 氯化钠清洗匀浆器以避免交叉污染。取匀浆后样本1 ml置于离心管中,室温8 000 r离心5 min后,去掉上层。血细胞在1 ml的Tris缓冲液I(10 mmol/L Tris?HCl,pH 8.0;10 mmol/L 氯化钾;10 mmol/L 氯化镁;2 mmol/L EDTA,pH 8.0;25 mL/L Triton X?50)中裂解10 min, 其间轻轻用力充分混匀, 室温10 000 r离心2 min,沉淀要用Tris 缓冲液I洗2次。将沉淀用220 μl的Tris 缓冲液II (10 mmol/L Tris?HCl,pH 8.0;10 mmol/L 氯化钾;10 mmol/L 氯化镁;2 mmol/L EDTA,pH 8.0;0.4 mol/L 氯化钠;10 g/L SDS)悬浮,轻轻振荡试管, 使底部细胞团块散开,在56 ℃保温15 min裂解。加入50 μl 5 M 氯化钠充分振荡沉淀去除蛋白质。10 000 r离心5 min,取上清。加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA后,10 000 r离心5 min,弃上清。室温晾20 min左右待酒精挥发干净后以适量TE缓冲液(10 mmol/L Tris?HCl,pH 8.0,1 mmol/L EDTA)回溶。EDTA抗凝血中DNA的提取从去掉上层开始。  1. 3 DNA浓度检测 用分光光度计在260 nm测DNA浓度。  1. 4 DNA纯度检测 DNA的纯度用A260/A280比值表示[3]。结果以均值±SD表示。  1. 5 DNA分子量检测 DNA样本的完整性用0.7%琼脂糖凝胶电泳证实,溴化乙锭染色,紫外灯观察。  1. 6 PCR检测 PCR扩增组织型纤溶酶原激活因子(t?PA)第8内含子Alu等位基因插入(I)和缺失(D)二态性[6]来评价DNA的可靠性。PCR引物序列如下:Alu1 5'?GTA AGA GTT CCG TAA CAG GAC AGC T?3', Alu2 5'?CCC CAC CCT AGG AGA ACT TCT CTT T?3'。反应体系组成为:10×PCR buffer 5 μl , 25 mM 氯化镁 6 μl , 10 mM each dNTPs 1 μl , 10 μM primer上下游各1 μl , DNA 2 μl ,Taq酶1 μl 。PCR反应程序为:95 ℃5 min预变性,然后94 ℃ 1 min ,58 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min循环40次,在72 ℃充分延伸10 min。  1. 7 结果 以均值±SD表示。

2014-08-12
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